293T細胞在培養的過程中的特別注意事項有哪些？

 HEK-293T細胞是293T（293tsA1609neo）細胞系（ATCC CRL-11268）的衍生物。細胞持續表達SV40抗原，該細胞常用于轉染實驗，轉染效率較高。（轉染一般以50%密度鋪板，待細胞剛剛貼到皿壁上后（一般8-10小時），即可進行轉染操作）

293T細胞的培養條件除了用DMEM（推薦iCell-0001）培養基；胎牛血清，10%；還要添加L-谷氨酰胺（2mM）1%；NEAA  1% ； 雙抗 1%等添加物，但是293T細胞在培養的過程中貼壁能力較弱，在培養過程中特別要注意：

先，293T細胞貼壁能力較弱，培養時可酌情使用預鋪0.2%明膠的培養瓶/培養皿。wan全培養液中需添加熱滅活胎牛血清。細胞生長不能過密，過密細胞容易脫落，脫落下來的細胞可以通過離心收集，使用0.25% Trypsin-0.53 mM EDTA 消化后繼續培養。

其次，如果發生293T細胞不貼壁，漂浮在培養基中的現象，請確認所使用的DMEM中碳酸氫鈉濃度及培養箱中CO2濃度。并參考以下培養體系：

a) DMEM由1.5 g/L碳酸氫鈉配制而成，使用5％CO2培養箱。

b) DMEM由3.7 g/L碳酸氫鈉配制而成，使用10％CO2培養箱。

當使用碳酸氫鈉含量高的培養基時，必須將這些細胞在10％CO2中孵育，以便正確緩沖培養基。當培養基沒有適當緩沖時，239T細胞雖然可以存活，但將無法粘附并保持漂浮在培養基中。

293T細胞為懸浮和輕微的貼壁細胞，傳代可以參考以下方法：

1. 收集：將培養瓶中的懸浮的細胞收集到離心管中。用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。由于細胞貼壁不牢PBS潤洗后細胞會脫落所以PBS也要回收到離心管中。

2. 加入0.25％（w / v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培養瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL）置于37℃培養箱中消化1-2分鐘（難消化的細胞可以適當延長消化時間），然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養瓶后加入3-4ml含10%FBS的培養基來終止消化。

3. 將收集到的懸浮細胞、pbs清洗液中的細胞和消化下來的貼壁細胞以1000rpml離心5min，棄去上清，補加1-2mL培養液后重懸混勻后將細胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照說明書要求配置的新的wan全培養基以保持細胞的生長活力，后續傳代根據實際情況按1:2~1:5的比例進行。

3） 細胞凍存: 收到細胞后建議在培養3代時凍存一批細胞種子以備后續實驗使用。

293T細胞參考文獻：

【1】Ding L, Zeng Q, Wu J, et al. Caveolin1 regulates oxidative stressinduced senescence in nucleus pulposus cells primarily via the p53/p21 signaling pathway in vitro[J]. Molecular Medicine Reports, 2017, 16(6): 9521-9527.

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